TÁCH CHIẾT RNA BẰNG RNEASY MINI KIT

TÁCH CHIẾT RNA BẰNG RNEASY MINI KIT
I. Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất:
1. Dụng cụ:
 RNase-free tips
 Eppendorf 1.5 ml
 Dụng cụ nghiền mô , giấy bạc, kéo, kẹp (đã hấp và sấy)
 Pipet 1000 µl và 200 µl
 Chuẩn bị thùng đá
 Bật sẵn máy ly tâm lạnh trước 30 phút
2. Hóa chất:
 RNeasy Mini Kit
 -mercaptoethanol (biến tính protein)
 Cồn 70 lạnh
 Cồn 96-100% (dùng để add vào các buffer yêu cầu trong bộ kit
Trước khi tiến hành cần:
Pha hóa chất đối với kit mới:
 Thêm -mercaptoethanol (-ME) vào buffer RLT (với 75 µl -ME / 1ml RLT). Chú ý: bảo quản ở 15-25oC
 Thêm 4 V ethanol (96-100%) vào RPE
 Chuẩn bị DNase I stock : thêm 550 µl RNase-free water vào DNase I stock
Khu vực thí nghiệm:
 Khử trùng khu vực tách RNA bằng cồn 70
 Trải giấy bạc khu vực tách
Chuẩn bị mẫu:
Cắt mô (mô tươi hoặc mô đông lạnh) m ≤ 30 mg (thao tác nhanh và phải để trên đá)
Các bước tiến hành
Bước 1: ly giải
1. Cho 600µl buffer RLT rồi nghiền mô bằng dụng cụ nghiền mô hay rotor-stator homogenizer
2. Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 3 phút. Hút dịch nổi rồi chuyển tất cả vào một eppendorf mới.
Bước 2: Tủa RNA
3. Thêm 1V ethanol lạnh 70% (bằng thể tích chứa trong eppendorf, lớn hơn thể tích dung dịch RLT thêm vào), huyền phù nhẹ nhàng. Chú ý: không ly tâm và làm bước 5 ngay lập tức.
4. Chuyển tất cả dung dịch vào cột lọc (spin column).
5. Ly tâm lạnh ≥ 10 000 rpm trong 15 giây. Loại bỏ dịch.
Bước 3: Rửa
6. Thêm 700 µl Buffer RW1 vào cột lọc.
7. Ly tâm lạnh ≥ 10 000 rpm trong 15 giây. Đổ bỏ dịch lọc.
8. Thêm 500 µl Buffer RPE vào cột lọc.
9. Ly tâm lạnh ≥ 10 000 rpm trong 15 giây. Đổ bỏ dịch lọc.
10. Thêm 500 µl Buffer RPE vào cột lọc.
11. Ly tâm lạnh ≥ 10 000 rpm trong 2 phút. Chuyển cột lọc vào một ống thu hồi mới (collection tube).
12. Ly tâm khô tốc độ tối đa trong 1 phút. Chuyển cột lọc vào một eppendorf 1.5ml.
Bước 4: Thu nhận mRNA
13. Thêm 30-50µl nước không RNase vào giữa màng lọc.
14. Ly tâm lạnh ≥ 10 000 rpm trong 1 phút. Bỏ cột lọc, đậy nắp eppendorf 1,5 ml, ghi chú lên eppendorf. Chú ý: lặp lại bước 14 nếu lượng RNA > 30µg.
15. Bảo quản -800C.



Tổng hợp cDNA
Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích (µl)
10X Buffer 2.0
dNTP 4.0
MgCl2 1.4
DTT 1.0
RNase Inhibitor (20U/µl) 1.0
MultiScribe RT (50U/µl) 1.0
RNA 8.6
Tổng 20

Tổng hợp cDNA với chu trình nhiệt:
250C / 10 phút
370C / 30 phút
950C/ 5 phút
40C/ giữ
Giữ -200C cho đến khi sử dụng

Kết quả (Anh) 1:

RNA EXTRACTION USING THE RNEASY MINI KITI. prepare instrument:1. Tools: RNase-free tips 1.5 ml Eppendorf the grinding tool, tissue forceps, scissors, (cleaning and drying) Pipet 200 µ µ l and 1000 l prepare ice bins  Turned Cold centrifuge available before 30 minutes2. Chemical substances: RNeasy Mini Kit -mercaptoethanol (denatured proteins) Alcoholic 70 conditioning Alcoholic 96-100% (used to add into the buffer required in the kitBefore you proceed:New kit for chemical phase:  Add -mercaptoethanol (-ME) into buffer RLT (with 75 µ l -ME/1 ml RLT). Note: preserved at 15-25° c Add 4 V ethanol (96-100%) to the RPE prepare the DNase I stock: Add 550 µ l DNase RNase-free water to I stockTest area: disinfected the area separating RNA with alcohol 70 Cover foil area split Sample preparation:Cutting the tissues (fresh frozen tissue or tissue) m ≤ 30 mg (fast and right to on the rocks) The steps proceedStep 1: cups tournament1. For 600 µ l buffer RLT and then crushed by the grinding tools tissue or tissue homogenizer stator-rotor2. Centrifuge at full speed for 3 minutes. -Room to float and then move it all into a new eppendorf.Step 2: Precipitate RNA3. Add cold 70% ethanol 1V (by capacity in eppendorf, larger than the volume of solution added RLT) suspension, gently. Note: centrifugal and not do step 5 immediately. 4. Move all the solution in the filter column (spin column). 5. Centrifuge the cold ≥ 10 000 rpm for 15 minutes. Remove room. Step 3: Rinse6. Add 700 µ l Buffer RW1 onto the filter column.7. Centrifuge the cold ≥ 10 000 rpm for 15 minutes. Pour translate filter. 8. Add 500 µ l Buffer RPE to filter columns.9. Centrifuge conditioning ≥ 10 000 rpm for 15 minutes. Pour translate filter.10. Add 500 µ l Buffer RPE to filter columns.11. Centrifuge conditioning ≥ 10 000 rpm for 2 minutes. Move columns to filter on a new withdrawal tube (collection tube).12. dry centrifuge for 1 minute at maximum speed. Move columns to filter into a 1.5 ml eppendorf. Step 4: collect mRNA13. Add 30-50 µ l water no RNase between the membrane filter. 14. cold centrifuge ≥ 10 000 rpm for 1 minute. Remove the filter, column cover 1.5 ml eppendorf, notes up eppendorf. Note: repeat step 14 if the amount of RNA > 30 µ g. 15. Maintenance-800C.CDNA synthesis CDNA synthesis reaction componentsVolume component (µ l)10 x Buffer 2.0dNTP 4.01.4 MgCl2DTT 1.0RNase Inhibitor (20U medium speed/µ l) 1.0MultiScribe RT (50U/µ l) 1.0RNA 8.6A total of 20CDNA synthesis with thermal cycle: 250 c/10 minutes370C/30 minutes950C/5 minutes40 c/holdKeep-200 c until use

Kết quả (Anh) 2:

RNA extraction KIT WITH MINI RNEASY
I. Preparation tools and chemicals:
1. Tools:
 RNase-free tips
1.5 mL Eppendorf 
 tissue grinding tools, silver paper, scissors, forceps (steamed and dried)
 l and 200 l Pipettes 1000
 Prepare ice boxes
available centrifuge  Turn Cold Front 30 minutes
2. Chemicals:
 RNeasy Mini Kit
 -mercaptoethanol (denatured protein)
 Alcohol cold 70
 96-100% alcohol (used to add to the buffer requirements in the kit
Before you proceed to:
Phase chemicals for kit new:
Add -mercaptoethanol  (-ME) in RLT buffer (75 l -ME / 1ml RLT). Note: 15-25oC stored at
4 V  Add ethanol (96-100%) in RPE
 prepare DNase I stock: 550 l RNase-free more water into the DNase I stock
experiment area:
 separate RNA region Disinfection with alcohol 70
area  Spread foil cup
preparation:
Cut the tissue (fresh tissue or tissue frozen) m ≤ 30 mg (to be quick and on ice)
steps
step 1: lysis
buffer RLT 1. 600μl tissue and crushed by grinding tools or rotor-stator homogenizer model
2. Centrifuge at the maximum speed for 3 minutes. Smoke supernatant and transfer it all into a new Eppendorf.
Step 2: Tua RNA
1V 3. Add the cold ethanol 70% (by ​​volume contained in Eppendorf, a larger volume of solution added RLT ), the slurry gently. Note: centrifugal and do not immediately step 5.
4. Move all filter the solution into the column (spin column).
5. Cold centrifuge ≥ 10 000 rpm for 15 seconds. Eliminate translation.
Step 3: Rinse
6. Add 700 l Buffer RW1 to the filter column.
7. Cold centrifuge ≥ 10 000 rpm for 15 seconds. Discard the filtrate.
8. Add 500 l Buffer RPE into the filter column.
9. Cold centrifuge ≥ 10 000 rpm for 15 seconds. Discard the filtrate.
10. Add 500 l Buffer RPE into the filter column.
11. Cold centrifuge ≥ 10 000 rpm for 2 minutes. Transfer filter column on a new recovery tube (collection tube).
12. Dry centrifugal maximum speed for 1 minute. Transfer filter column on a single 1.5mL Eppendorf.
Step 4: Acquire mRNA
13. Add water 30-50μl RNase mid membranes.
14. Cold centrifuge ≥ 10 000 rpm for 1 minute. Skip filtration column, 1.5 mL Eppendorf cap, notes to Eppendorf. Note: repeat step 14 if the amount of RNA> 30μg.
15. Preservation -800C.



CDNA Synthesis
Composition cDNA synthesis reaction
composition Volume (l)
2.0 Buffer 10X
dNTP 4.0
MgCl2 1.4
1.0 DTT
RNase Inhibitor (20u / l) 1.0
MultiScribe RT (50U / l) 1.0
RNA 8.6
Total 20

cDNA Synthesis with thermal cycle:
250C / 10 minutes
370C / 30 minutes
950C / 5 min
40C / hold
hold -200C until use